摘要：為了研究胞質(zhì)分裂過程中子細胞表面張力與細胞間橋變形之間的聯(lián)系，采用微管吸吮實驗測定了正常大鼠腎上皮細胞(NRK)在細胞松弛素D(即CD)或blebbistatin作用下細胞表面張力的變化，并且采用局部施加CD的方法分析了兩極子細胞表面張力非平衡狀態(tài)下細胞間橋的變形曲線。研究結(jié)果認為，CD和blebbistatin均可以大幅降低細胞表面張力；整體施加blebbistatin抑制細胞主動性收縮會導(dǎo)致細胞間橋變形完全受到子細胞表面張力的調(diào)控，細胞間橋變形過程反映出細胞調(diào)節(jié)整體表面張力的進程。

動物細胞的胞質(zhì)分裂過程伴隨一系列精巧而又相對簡單的細胞形態(tài)學(xué)改變。首先，細胞變圓拉長；隨后在赤道板形成分裂溝并開始收縮，兩極子細胞中間出現(xiàn)細胞間橋；最后，細胞間橋變細、斷裂，生成兩個子細胞。胞質(zhì)分裂是一個典型的力學(xué)變形過程，與細胞皮層力學(xué)特性的改變關(guān)系緊密，細胞間橋變形的過程由分裂溝主動收縮和細胞各部分表面張力協(xié)調(diào)控制。

細胞表面張力是細胞皮層力學(xué)的一個重要參數(shù)，可能是肌動—肌球蛋白相互作用的結(jié)果。研究表明：完整的肌動蛋白骨架系統(tǒng)對于張力的產(chǎn)生必不可少，肌球蛋白II突變的黏菌細胞表面張力較正常黏菌細胞降低70%。因此，細胞表面張力成為衡量肌動蛋白和肌球蛋白動力學(xué)變化的一個重要指標，例如肌動蛋白和肌球蛋白的濃度分布，肌動蛋白纖維排列以及肌球蛋白輕鏈磷酸化激活等。胞質(zhì)分裂過程中，極區(qū)子細胞的表面張力與細胞間橋變形的聯(lián)系是胞質(zhì)分裂動力學(xué)的重要研究對象，對探索胞質(zhì)分裂的機制具有積極作用。

本文利用雙微管局部加藥手段通過施加細胞松弛素D抑制單側(cè)極區(qū)子細胞皮層肌動蛋白的裝配從而改變子細胞表面張力。實驗中采用肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑blebbistatin抑制細胞的主性動收縮，在對比不同驅(qū)動力作用下細胞分裂溝間橋變形的基礎(chǔ)上，分析了極區(qū)皮層表面張力在不同收縮力狀態(tài)下對變形過程調(diào)控的差異。通過細胞間橋變形的趨勢，研究和分析了子細胞表面張力與胞質(zhì)分裂細胞間橋變形的聯(lián)系。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

正常大鼠腎上皮細胞(Normal rat kidney epithelial cells，以下簡稱NRK)購于中國科學(xué)院上海細胞庫，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)中，內(nèi)含體積分數(shù)10%的胎牛血清(四季青公司)。在體積分數(shù)5%的CO?、37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，待用。

1.2整體和局部抑制劑處理

對數(shù)生長期的NRK細胞經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶消化5 min后輕輕吹打至懸浮。分別采用抑制肌動蛋白聚合的2μmol/L CD、抑制肌球蛋白II的ATP酶活性抑制劑30μmol/L blebbistatin處理細胞15 min。用沒有加入骨架蛋白抑制劑的細胞作為對照組。

先將(—)-blebbistain對映體(Sigma公司)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配置成10 mmol/L的blebbistatin溶液，再加入三蒸水配成5 mmol/L儲存液，—20℃保存。使用時用DMEM培養(yǎng)液進行稀釋至終濃度為30μmol/L，內(nèi)含體積分數(shù)0.3%的DMSO。利用blebbistatin處理細胞15～20 min后開始局部施加抑制劑。將CD(Sigma公司)配成100μmol/L的儲存液，內(nèi)含體積分數(shù)0.5%的DMSO，—20℃保存。使用時用含0.5 g/L羅丹明熒光素(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋，使用濃度為5μmol/L，約含體積分數(shù)0.02%的DMSO。

將抑制劑注入加藥微管，加藥微管直徑約3μm，吸藥管直徑約30μm，兩管相距約30μm。通過氣泵調(diào)節(jié)壓力，控制藥物作用范圍直徑約15μm。加藥管靠近子細胞一端極區(qū)，以避免加入的抑制劑流入分裂溝處。加入CD的范圍和濃度變化可以通過羅丹明熒光素顯示，熒光強度的變化代表抑制劑作用濃度梯度，施加的抑制劑在距離中心15μm以外的范圍濃度很低，見圖1。

圖1局部施加抑制劑的范圍和濃度變化

1.3細胞表面張力的測定

采用芬蘭Kibron公司生產(chǎn)的Delta-8全自動高通量表面張力儀對細胞膜表面張力進行間接評估。該儀器基于朗繆爾單層原理，通過測量氣液界面吸附膜的平衡表面壓力來反映膜材料的表面張力特性。

樣品準備與測量：

對數(shù)生長期的NRK細胞經(jīng)質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶消化后，收集細胞并用PBS洗滌兩次。通過細胞計數(shù)調(diào)整細胞密度，制備成單細胞懸液。將含有細胞骨架蛋白抑制劑（CD、blebbistatin或其組合）的處理組細胞懸液及未經(jīng)處理的對照組細胞懸液分別上樣至儀器樣品板。

測量過程：

儀器自動監(jiān)測氣液界面的表面壓力變化。細胞在界面處發(fā)生吸附并形成單層膜，其膜脂與皮層蛋白的力學(xué)特性會影響界面的平衡表面壓力（π平衡）。細胞膜的表面張力（γ細胞膜）可通過公式γ細胞膜=γ_0-π平衡進行估算，其中γ_0為純培養(yǎng)基的表面張力（約為72 mN/m）。儀器自動記錄達到平衡后的表面壓力值，每組實驗重復(fù)至少6次。

1.4細胞間橋的測量和細胞間橋動力學(xué)模型

定義間橋直徑與間橋長度相等時刻的相對直徑為1，其它各時刻的相對直徑等于各時間點間橋直徑與上述直徑絕對值的比，對間橋直徑進行無量綱化。規(guī)定間橋直徑與間橋長度相等時的時刻為0 s，則所有曲線均過(0,1)點，定義(0,1)點為D?(見圖2)，使曲線更具有直觀性和可比性。對表觀速度進行如下規(guī)定：D?之前的表觀速度為間橋直徑在-200~0 s時間段的速度；D?之后的表觀速度為間橋直徑在0～200 s時間段的速度。

圖2 NRK細胞形態(tài)學(xué)參數(shù)隨時間變化曲線

實驗采用間橋變細動力學(xué)模型對間橋變形進行分析和模擬，見圖3。該模型認為：肌球蛋白II所產(chǎn)生的徑向應(yīng)力為主動力，促進胞漿從間橋向兩個子細胞流動；間橋末端以及子細胞胞漿黏性產(chǎn)生的軸向應(yīng)力為被動力，阻礙胞漿從間橋向兩個子細胞流動。間橋半徑隨時間變化的函數(shù)表達式為：

1.5數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計學(xué)分析

用微管吸吮測量細胞表面張力，采用100倍物鏡，10倍目鏡；對細胞形態(tài)變形進行測量實驗，采用40倍物鏡，10倍目鏡，兩者均通過中繼放大50%。圖像采集均通過冷CCD(DP71，Olympus)進行圖像采集，間隔4 s取像。采用圖像處理軟件(Image Pro 5.1，Olympus)進行形態(tài)學(xué)測量。不同細胞組數(shù)據(jù)用OriginPro 8.0處理，用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件及方差分析比較組間差異，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。